慢病毒包装试剂盒
慢病毒包装试剂盒
本试剂仅供研究使用，不得使用于临床及其目的。本试剂盒用于包装高质量的慢病毒。
试剂盒组成：
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试剂盒组成 |
10cm 配置 |
保存 |
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说明书一份 |
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包装质粒 |
10T/20T | -20˚C |
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Polybrene感染增强液 |
50ul | -20˚C |
实验流程
慢病毒包装流程图：
一、慢病毒包装操作步骤：
1. 转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2X107细胞/20ml，接种于15cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养16h待细胞密度达70%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2. 转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3. 向一灭菌离心管中加入重组骨架载体，包装载体，与相应体积的 Opti-MEM 混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5分钟。
4. 将 Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与 2.4 ml Opti-MEM 混合，在室温下温育5分钟。
5. 把稀释后的DNA与稀释后的 Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在 5 分钟之内混合。
6. 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7. 将 DNA 与 Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中混匀，于 37℃, 5%CO2 细胞培养箱中培养。
8. 培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入 20 ml 的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
9. 每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基 25ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。
10. 收集上清液，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μm PVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中。
11. 4℃，50000g 高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。
12. 小心弃去上清，晾干，按 200ul/10cm 培养皿的量加入PBS重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀（避免产生气泡），继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中，-80 ℃冰箱保存。
二 慢病毒生物学滴度测定操作步骤：
1）在滴度测定前一天取48孔板，加入3X104cell/孔 HEK 293 细胞。
2）用 DMEM完全培养基 10倍梯度稀释病毒。具体做法如下：取96孔板，每孔含有90ul培养基，第一横排孔每孔加入10ul待测病毒原液，混匀后吸取10ul混合液至第二横排孔（混匀时尽量不要产生气泡），如此稀释至第六横排孔。
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滴定量 |
1μL |
0.1μL |
0.01μL |
0.001μL |
0.0001μL |
…… |
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病毒液 |
5or10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
…… |
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DMEM完全培养基 |
45or90 |
90 |
90 |
90 |
90 |
…… |
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上样量 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
…… |
注意：每次移液都必须换用新的枪头，否则就会将枪头外面的病毒带入到下一孔，导致过高估计滴度的终点。
3）吸10ul病毒混合液加入到相对应的48孔板中。
4）经72小时感染，借用荧光显微镜计数荧光细胞情况。一般情况下(如果观察不清楚可先换PBS再进行观察），在最高稀梯度m的孔数出N（N<10）个带荧光的细胞,则病毒滴度为Nx10m/ul（m为稀释倍数），即病毒滴度为Nx10m+3TU/ml，若N>10，则需继续稀释。(如果病毒荧光较弱可加入polybrene以便增强病毒感染。