北京欧林格生物科技有限公司

慢病毒包装试剂盒

发布时间:2019-08-31   浏览次数:

本试剂仅供研究使用,不得使用于临床及其目的。本试剂盒用于包装高质量的慢病毒。

试剂盒组成:

试剂盒组成 10cm 配置 保存
说明书一份 -- --
包装质粒Mix 10T/20T/50T -20˚C
Polybrene感染增强液 50ul -20˚C

慢病毒包装经验总结

1.质粒质量(这也是我们试剂盒存在的原因)

   1)260/280 比值1.8左右

   2)浓度500ng/ul 以上

   3) 跑胶鉴定 无RNAse 污染

   4)超螺旋比例在90%以上

  我们的包装质粒无内毒素抽提后,经过了病毒包装测验,原液出毒效率达到1E+7TU/ml.

2. 细胞状态

1)细胞状态良好健康,无支原体,细菌,真菌等污染。

为什么有的客户细胞传着传着就状态就不好,需要从头养一支。据称有的人为了夸赞自己的包装细胞,说隔一段时间就从ATCC 购买一支新的。这在我看来很扯淡。ATCC的细胞从哪里来?大部分是从研究所搜集而来。从源头讲,atcc拿到的细胞也不知道建株后多少代了,那么强调多少代的意义何在?大概率是因为自己养细胞水平差,养着养着细胞状态挫了。只要是状态好的时间冻存的细胞,都有媲美ATCC细胞的质量。

3. 转染效率

有了好的质粒,好的细胞状态,还要匹配好的转染试剂,我司配套的转染试剂,毒性小,转染效率高.

慢病毒包装流程图:

 

一、慢病毒包装操作步骤:

1)转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2X107细胞/20ml,接种于10cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内培养16h待细胞密度达70%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

3)向一灭菌离心管中加入重组骨架载体(5ug),包装载体MIX(5ug)共计10ug,与相应体积的Opti-MEM混合均匀,调整总体积为1ml,在室温下温育5分钟。

4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀,取40μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与相应体积的Opti-MEM混合,调整总体积为1ml,在室温下温育5分钟。

5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合,轻轻地颠倒混匀,不要振荡。必须在5分钟之内混合。

6)混合后,在室温下温育20分钟,以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中混匀,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。

8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基,每皿细胞加入1ml的PBS液,轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物,然后倒去。

9)每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基10ml,于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。

10)收集上清液,1000rpm离心5min,弃去细胞碎片,上清液以0.45μmPVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中。

11)4℃,50000g 高速离心2h,离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。

12)小心弃去上清,晾干,按200ul/10cm培养皿的量加入PBS重悬病毒沉淀,室温静置2h,然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡),继续室温放置30min,按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中,-80 ℃冰箱保存。

慢病毒生物学滴度测定操作步骤:

1)在滴度测定前一天取48孔板,加入3X104cell/孔HEK 293细胞。

2)用DMEM完全培养基10倍梯度稀释病毒。具体做法如下:取96孔板,每孔含有90ul培养基,第一横排孔每孔加入10ul待测病毒原液,混匀后吸取10ul混合液至第二横排孔(混匀时尽量不要产生气泡),如此稀释至第六横排孔。

滴定量 1μL 0.1μL 0.01μL 0.001μL 0.0001μL ……
病毒液 5or10 10 10 10 10 ……
DMEM完全培养基 45or90 90 90 90 90 ……
上样量 10 10 10 10 10 ……

注意:每次移液都必须换用新的枪头,否则就会将枪头外面的病毒带入到下一孔,导致过高估计滴度的终点

3)吸10ul病毒混合液加入到相对应的48孔板中

4)经72小时感染,借用荧光显微镜计数荧光细胞情况。一般情况下(如果观察不清楚可先换PBS再进行观察),在最高稀梯度m的孔数出N(N<10)个带荧光的细胞,则病毒滴度为Nx10m/ul(m为稀释倍数),即病毒滴度为Nx10m+3TU/ml,若N>10,则需继续稀释。(如果病毒荧光较弱可加入polybrene以便增强病毒感染细胞的能力)

 


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