北京欧林格生物科技有限公司

CCK8细胞增殖实验


实验一:细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),同样的样本可做4-6个重复。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。

2、向每孔加入10 μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。

4、用酶标仪测定在450nm-490nm处的吸光度。

5、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

实验二:细胞增殖-毒性检测

1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。同样的样本可做4-6个重复,将培养板在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。

2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。

4、向每孔加入10μL CCK8溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。

6、用酶标仪测定在450nm-490nm处的吸光度。

7、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

 

预实验 1、种板数;2、种板后细胞的贴壁生长时间;3、加药后的孵育时间;4、cck8试剂加入量;5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。
 
1、种板数:这个要查文献,看你所用细胞别人有无做过,把范围大致找出。记住还要参考说明书,这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全,一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内,不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间,那么在4天内,细胞是刚好铺满还是堆积生长?因为每块板都会设置对照孔,也就是含有细胞的培养基+CCK8,这个数值是板上的最大数值,CCK8试验最佳OD值在1.0附近,所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满,一旦长满了很难去判断是否堆积生长了,对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一,其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大,而且OD值也很大。
 
2、贴壁生长的时间一般直接24h了,这个时间细胞已经贴壁完全。
 
3、加药后的孵育时间,24h,48h,72h。然后根据数据的稳定性(RSD)、OD值的范围(1.0左右)这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了。
 
 
4、cck8试剂加入后孵育时间,随着时间的增加,OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
 
        再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔,得到的OD值去掉最大值与最小值,其余取平均值。我用的是排枪,会省很多力气,但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
 
        做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定,组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件,其实就一个原则,把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数,借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心,尽量平行操作。


服务内容


您需要提供以下材料:

细胞,试剂盒(可代购)。

您将获得以下结果:

  • (1)实验数据;
  • (2)数据分析;
  • (3)实验报告。
1.质量保证 2.发货时间 3.售后处理
我司产品发货前均经过质量检测,确保您收到的产品质量准确无误! oligobio拥有大量的现货产品,本公司的现货产品从订货日期起一周以内即可到货,大大缩短了您的等待时间!另外oligobio的快速克隆及病毒包装平台也能让您体验到前所未有的快速定制服务! oligobio所售出的产品全部登记在册,如果您拿到我们的产品觉得和实质不相符或存在问题,您只需要告诉我们相关产品信息我们会迅速做出反应,为您提供解决方案
4.订购流程 5.联系我们 6.相关服务
联系我们→技术人员或销售人员与您沟通→签订合同→支付预付款→执行项目→确认收货→支付尾款→售后服务 oligobio提供免费的技术咨询,任何关于产品或者技术问题,都可以联系我们们。 免费热线:13321116807 服务邮箱:wangyuteng@oligobio.com.cn

基因合成,亚克隆构建,3‘UTR验证实验

启动子合成及验证,慢病毒包装,腺病毒包装

腺相关病毒包装,稳转株构建

 

 


查看购物车

公司地址:北京市海淀区白家疃尚水园4号楼    联系电话:13321116807    邮箱:oligobio@163.com
COPYRIGHT © 2019-2020 欧林格生物 ​​all rights reserved   
京ICP备15023820号
本站由嵩信网络提供技术支持