北京欧林格生物科技有限公司

                                                                                              产品简介
      欧林格生物慢病毒包装试剂盒，对包装系统进行了优化，增加了我司特有的慢病毒出毒增强液。相同的包装量，相比较实验室常规的包装体系能增加3-10倍的出毒量，让您的病毒包装简单快捷，让初学者也能快速包装高滴度的慢病毒。试剂盒的组分包含包装质粒、转染试剂、慢病毒出毒增强剂等。适用于基因过表达和干扰慢病毒的包装，以及后续稳定细胞株的构建。

客户只需构建骨架质粒，和试剂盒中的包装质粒Easy Mix按1：1混合，用LipoX Transfection Reagent将混合后的质粒转染293T细胞，8h就能看到荧光，48h就能收获高滴度的慢病毒，利用慢病毒浓缩液或者超滤柱能快速浓缩纯化病毒，为后续的感染实验提供高纯度高滴度的病毒。

产品组分

运输与保存方法
冰袋运输。组分均于-20℃保存(注意：转染试剂 LipoX 需4℃保存)
质粒准备
慢病毒骨架质粒构建与大提：构建含目的基因或shRNA的骨架质粒，并进行大提获得足够质量的无内毒素质粒，且所提质粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于0.8μg/μl。

细胞状态：选择状态良好的293T细胞进行病毒包装，尽量选择低代数细胞。

实验流程
1）293T细胞准备：转染前一天，将已经状态良好的293T细胞以合适比例接种到10cm培养皿中，当细胞长到80%左右时准备转染；
2）转染：转染前视细胞状态和密度决定是否提前换液。取两个无酶无菌的1.5ml EP管，在A、B管中先都加入500μl Opti-MEM，然后再分别加入质粒和转染试剂，详细内容参考下表：

将B管转染试剂混合液加到A管中，轻轻混匀后，室温放置15min~20min后，再将AB管混合液加到细胞中摇匀然后加入出毒增强剂300ul(10ml体积加300ul)，置于CO2培养箱继续培养；
3）换液：转染过液后，小心弃掉细胞上清（注意收集上清后需要灭菌处理），然后加入10ml新鲜的培养基继续培养；
4）病毒收集：换液36-48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃保存，再重新加入10ml新鲜的培养基，24h后再收集一次细胞上清于第一次的离心管中；
5）病毒处理：4℃，4000rpm离心10min收集上清液，并用用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。对病毒进行分装保存，可以直接用于下游实验。如果对病毒的滴度及纯度有较高要求，可用本公司的慢病毒浓缩液（OGL–CELL002）对病毒原液进行浓缩与纯化。也可以使用超滤管超滤实现病毒的浓缩；
6）病毒浓缩：使用本公司的慢病毒浓缩液（OGL–CELL002）进行病毒的浓缩，按病毒原液的1/4体积加入病毒浓缩液，混匀后4℃过夜（每20～30min混合一次，共进行3-5次）。第二天，4℃，4000rpm，离心 20min，吸弃上清后静置管子1～2分钟，吸走残余液体，再加入适量的PBS或培养基溶解慢病毒沉淀；超滤选择100KD大小的超滤管，4000-6000rpm，4℃离心。

7）病毒分装与保存：将病毒原液或浓缩液按合适体积进行分装，再保存于-80℃。
注意事项

1、构建稳定细胞株时，可用病毒感染增强剂和嘌呤霉素对细胞进行感染和筛选。

2、为了您的健康，实验操作过程尽量在生物安全柜中完成，并做好个人防护，请穿实验服和带一次性手套。所有实验废弃物均需要进行灭菌处理。

3、小量病毒包装时，也可以使用小提质粒。转染时如无opti-MEM，可以用PBS、生理盐水或无血清DMEM代替。

4、在慢病毒包装过程中使用opti-MEM培养基，将出毒增强剂按照比例（(10ml体积加300ul)加入opti-MEM培养基培养细胞，会获得更好的出毒效果。