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单条shRNA构建


 shRNA的构建:

一 简介

构建shRNA表达载体,实现shRNA在细胞中稳定表达,能够弥补瞬时转染持续时间短的不足。

慢病毒表达载体中,是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物 3’端形成 1~4 个 U。U6 和 H1RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达~19nt RNA 和~50nt RNA 茎环结构(stem loop)。在 siRNA 表达载体中,可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体内的位于 RNA聚合酶Ⅲ启动子和 4~5T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后可折叠成具有 1~4 个U. 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA。

这一段话本来不想贴的,但是大家都贴,我也就贴上来了,其实我是抄的。。。。。

 

二 常用载体图谱:

这个载体真的很牛X的,我来说说牛X的地方

a 既有荧光标记又有抗性筛选标记,双标啊。

    1) puro是最好用的抗生素没有之一(BSD太贵,不建议用带BSD的载体)

    2)ZsGreen这个荧光标签是真的亮,在荧光显微镜下,看一个个细胞被点亮,就像看到30年前夜空的星星(暴漏年龄)

    3)ZsGreen和puro由aT2A隔开,这设计太TMD精简了,大家都知道慢病毒包装载体越大出毒越低,我们这个载体出毒就没低于8次方的

b  U6启动子,shRNA发夹结构后面用连续的TTTTT结尾,也就是转录到这里就停停停下(转录的太多了会多一堆乱七八糟说不清楚的东西)

     如果靶点前面是A,T, C开始的我们会多添加一个G,据说有助于转录。

c  我司还有Cherry/BFP的载体/无荧光的供您挑选。

    这个是因为大家后面可能会做免疫荧光等实验,可以根据需要自行选择。

三靶点设计

    这个大家百度一下,太多文章讲了,我们就不讲了。

四  关于构建

     1)这个一般就是合成一对引物(59bp最经济实惠,怎么设计的刚好59bp您可以Q上联系我),退火,连接。easy的很。。。

         引物合成一般脱盐纯化就可以(土豪表示page 毫无压力,土豪土豪我们做PY吧)

         引物退火:把水烧开,退火的双链煮沸5min自然降至室温 百分百没问题

     2)酶切载体,酶切好坏是载体构建的关键步骤。为啥尼,引物公司给合成的,大部分没有质量问题。T4连接酶,Thermo,全式金,生工的我们都用过,

          质量都OK,自己保存不当出了质量问题的除外。所以大部分童鞋引物回来搞不定构建都是载体没切好。那么怎么切好载体呢,在这里我就提一点,

          就是买同一家的酶,推荐NEB和thermo的,我们比较喜欢FD快切酶,15min切好,妥妥的。

     3)感受态。商用的感受态一般来讲效率都还可以。QSJ,WD,ZM等公司的都可以。

           对于shRNA构建来讲,一条shRNA 半支感受态足以

五 关于鉴定

       shRNA的构建,我司根据自己的经验,可以PCR/酶切/测序鉴定两种方法。

       1)PCR鉴定

          由于插入的片段不大,只有59bp,在载体上设计引物 ,扩增的产物和空载体一起电泳,需要2%-3%的琼脂糖凝胶电泳,140V,电泳1h才能分开大小

       2)酶切鉴定

          发夹结构的loop环可以设计CTCGAG ,用XhoI的酶,能切开的自然就是构建成功的。

        3)测序鉴定

          构建成功率高的可以直接把板子给测序公司,挑克隆测序鉴定。

          现在一代测序公司竞争压力太大 8块,10块,12块,15块都有,所以经常会遇到测不过去的情况。所以选择一个好的测序公司能节省好多时间

 

好了,现在是广告时间,欢迎选择我们公司构建shRNA,速度块,质量好,价格美丽

您只需提供siRNA的靶序列或者基因信息给我们,7-10天就可以拿到测序正确的shRNA克隆。加急可以5天交付PCR/酶切鉴定的 shRNA菌液

 

服务流程:

1)mRNA序列分析;

2)引物设计及合成;

3)单链互补引物退火;

4)将片段克隆至载体;

5)测序以确保插入序列正确性;

客户提供:

目的基因的Accession Number(Human、Mouse或Rat种属);

我们提供:

1) 构建好的表达载体和相应的甘油菌;赠送阴性对照甘油菌;

2) 测序报告 ;

质量保证:

针对某靶基因设计的3条shRNA序列,在转染效率>80%的前提下,我们保证至少有1个克隆可以达到70%转录水平的沉默效率。

1.质量保证 2.发货时间 3.售后处理
我司产品发货前均经过质量检测,确保您收到的产品质量准确无误! oligobio拥有大量的现货产品,本公司的现货产品从订货日期起一周以内即可到货,大大缩短了您的等待时间!另外oligobio的快速克隆及病毒包装平台也能让您体验到前所未有的快速定制服务! oligobio所售出的产品全部登记在册,如果您拿到我们的产品觉得和实质不相符或存在问题,您只需要告诉我们相关产品信息我们会迅速做出反应,为您提供解决方案
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