EdU标记

细胞预实验中，建议设置一系列的EdU 浓度梯度，以确定最佳的细胞实验浓度。

1. 以每孔4×10³-1×10⁵细胞接种于96孔板中，进行药物处理或者其他刺激处理。
2. 准备一份2×的EdU工作液（组分A）：以完全培养基稀释10mM的储液至合适的工作浓度。建议您以10μM的初始工作浓度开始预实验。
3. 预热2×的EdU工作液，等体积加入细胞培养液中，使终浓度变为1×(如对于100μL的细胞培养液，若需要得到10μM的终浓度，则应加入100μL的20μM的2×EdU工作液)。

4. 选择合适的条件和时间孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

注意：EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐以10μM的EdU初始浓度进行摸索。细胞培养基,细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。

细胞固定及促渗

1. 孵育完成后，去除培养基。加入50μL4%中性多聚甲醛至各个孔，室温孵育15-30min后，去除固定液。
2. 每孔加入50 μL 2 mg/ml 甘氨酸溶液，室温孵育5 min， 中和残留的固定液。
3. 以每孔1 mL 3% BSA in PBS的洗涤液洗涤细胞2次。
4. 去除洗涤液，加入1 mL0.5%TritonX-100 in PBS到每个孔中，室温孵育20 min。

注意：本参考步骤是针对以4%中性多聚甲醛固定且以0.5%TritonX-100促渗操作样本而优化的操作方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等。

EdU检测

1. 准备1× Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）：10×组分C 试剂以去离子水稀释10倍即可。
2. 制备一份5×的Click-iT EdU反应添加物储液（组分E）： 加3mL去离子水至30m的E组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解（注：对于其他规格，由于组分E的量不同，需按比例扩大去离子水添加体积）。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解，制备成5×储液备用）。
3. 准备1× Click-iTEdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5×储液至1×，溶液应新鲜配置，当天用完。
4. 依据表1准备Click-iT反应混合物。表1要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

注意：本参考步骤每个孔反应使用100μL的Click-iT反应混合 物。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶 液体积。